Dentysta Kraków
Stomatologia i dentystyka w Krakowie

Izolacja nowego koronawirusa od człowieka z zapaleniem płuc w Arabii Saudyjskiej AD 4

Posted in Uncategorized  by admin
September 1st, 2019

Użyliśmy endonukleazy OmniCleave (Epicentre) do usuwania wolnego DNA i RNA, zgodnie z protokołem producenta. Wirusowe RNA ekstrahowano z supernatantów w zakażonych hodowlach komórkowych przy użyciu zestawu do izolacji o wysokiej czystości RNA (Roche). Aby usunąć ssaczo-rybosomalne RNA, użyliśmy zestawu do usuwania rRNA Ribo-Zero RZH110424 (Epicentre), zgodnie z protokołem producenta. RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu okrągłych permutowanych primerów 11, które zostały rozszerzone o losowe sekwencje heksamerowe. DNA amplifikowano za pomocą PCR z okrągłymi permutowanymi starterami. Sekwencję zamplifikowanych fragmentów przeprowadziliśmy za pomocą platformy sekwencyjnej Roche 454 GS FLX. Bibliotekę fragmentów utworzono zgodnie z protokołem producenta bez fragmentacji DNA (GS FLX Titanium Rapid Library Preparation, Roche). Oparty na emulsji PCR z amplifikacją (metoda amplifikacji Lib-L) i sekwencją sekwencjonowania GS był przeprowadzany zgodnie z instrukcjami producenta (Roche). Odczyty sekwencji wycięto przy 30 nukleotydach od końców 3 i 5 , aby usunąć wszystkie sekwencje starterów. Sekwencje odczytane z danych sekwencjonowania GS FLX zostały zmontowane na mapach kontigu (zestaw nakładających się segmentów DNA) przy użyciu oprogramowania CLC Genomics, wersja 4.6.1 (CLC Bio). Korzystając z platformy do sekwencjonowania 454, uzyskaliśmy około 90% sekwencji genomu wirusa. Następnie zaprojektowano specyficzne startery do amplifikacji zachodzących na siebie fragmentów o wielkości około 800 bp za pomocą PCR. Te produkty PCR oczyszczono z żelu i sekwencjonowano za pomocą zestawu do sekwencjonowania cykli BigDye Terminator v3.1 i analizatora genetycznego 3130XL, zgodnie z instrukcjami producenta.
Wyniki
Wykrywanie koronawirusa
Ryc. 2. Ryc. 2. Efekty cytopatyczne i drzewo filogenetyczne nowego koronawirusa. Panel A pokazuje efekty cytopatyczne w hodowli komórek LLC-MK2 i Vero po zaszczepieniu nowym koronawirusem HCoV-EMC. Panel B pokazuje związek genetyczny między HCoV-EMC i innymi koronawirusami w drzewku filogenetycznym o największej wiarygodności. Drzewo jest oparte na 408-nukleotydowym fragmencie otwartej ramki odczytu 1b. Zastosowano następujące wirusy i numery dostępu: wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów (FCoV, NC007025), HCoV-229E (NC002645), wirus świńskiej grypy świń (PEDV, NC003436), HCoV-NL63 (DQ445911), BatCoV-1A (NC010437), BatCoV-HKU8 (NC010438), BatCoV-HKU2 (NC009988), BatCoV-512 (DQ648858), koronawirus bydlęcy (BCoV, NC003045), HCoV-OC43 (AY585228), HCoV-HKU1 (AY884001), wirus zapalenia wątroby mysiej (MHV; NC006852 ), BatCoV-HKU5 (EF065509), BatCoV-HKU9 (EF065513), SARS-CoV (AY345988), BatCoV-HKU4 (EF065505), ptasiego zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV, NC001451), koronawirusa wieloryba Beluga (BWCoV, EU111742), oraz HCoV-EMC (JX869059)
[hasła pokrewne: tarchomed, trzmiel gajowy, sanatorium uzdrowiskowe solinka ]

Tags: , ,

No Responses to “Izolacja nowego koronawirusa od człowieka z zapaleniem płuc w Arabii Saudyjskiej AD 4”

  1. Marta Says:

    [..] Artukul zawiera odniesienia do tresci: opieka domowa warszawa[...]

  2. Mr. Lucky Says:

    Co roku co innego pisza

  3. Bartłomiej Says:

    [..] Odniesienie w tekscie do stres[...]

  4. Milena Says:

    Nie wiem już co robić

Powiązane tematy z artykułem: sanatorium uzdrowiskowe solinka tarchomed trzmiel gajowy